LAPORAN PRAKTIKUM : PROTEIN

I. PELAKSANAAN PRAKTIKUM

Tujuan	: - Memperlihatkan bahwa sebagai makromolekul yang larut dalam bentuk larutan koloid, protein dapat dipisahkan satu dari yang lain. - Memperlihatkan bahwa sebagai makromolekul yang larut, protein dapat dipisahkan d4engan mengendapkannya dengan penambahan etanol absolute.
Hari/Tanggal	: Selasa, 25 Mei 2010
Tempat	: Laboratorium Kimia, Lt.II, Fakultas MIPA
	Universitas Mataram

II. LANDASAN TEORI

Cairan dimana sel-sel darah terdapat ialah cairan berwarna kekuning-kuningan, disebut plasma. Komponen terbesar plasma adalah air yaitu sekitar 90%. Selain itu didalam plasma darah juga terkandung garam organik kurang dari 1%, protein besar 1% (terdiri dari albumin serum 4%, globulin serum 2,7%, dan fibrinogen 0,3%), dan bahan lainnya (makanan, limbah hormon, dsb) 2%. Protein dalam plasma memiliki konsentrasi sekitar 1 mmol/L. Dengan bantuan elektroforesis, protein plasma dapat dipisahkan menjadi fraksi albumin serta fraksi α1, α2, β, dan γ-globulin. Sekitar 56% protein plasma merupakan fraksi albumin, 4% adalah α1-globulin, α2-globulin sebanyak 10%, β-globulin 12%, dan 18% dari jumlah protein plasma merupakan γ-globulin. Setelah darah diambil dari sebuah vena dan dibiarkan membeku, bekuan darah berkerut secara lambat. Ketika hal itu terjadi, cairan bening disebut serum. Serum pada dasarnya merupakan plasma darah tanpa fibrinogen(Kimball, 2007: 518-519).

(Evanjie, 2010)

Serum terdiri dari semua protein (yang tidak digunakan untuk pembekuan darah) termasuk cairan elektrolit, antibodi, antigen, hormon, dan semua substansi exogenous. Rumusan umum yaitu: serum = plasma - fibrinogen - protein faktor koagulasi. Serum terbagi menjadi 4 jenis yaitu: a). Serum protein (bahasa Inggris: globular protein, spheroprotein) merupakan salah satu dari tiga jenis protein di dalam tubuh yang terbentuk dari asam amino berupa larutan koloidal di dalam plasma darah, b). Serum globulin adalah istilah umum yang digunakan untuk protein yang tidak larut, baik di dalam air maupun di dalam larutan garam konsentrasi tinggi, tetapi larut dalam larutan garam konsentrasi sedang, mempunyai rasio 35% dari protein plasma, berguna untuk sirkulasi ion, hormon dan asam lemak dalam sistem kekebalan, c). Serum lipoprotein adalah senyawa biokimiawi yang mengandung protein dan lemak yang dapat terikat secara kovalen maupun non kovalen dengan protein, dan d). Serum wewenang yang hanya berjumlah 1% dari protein plasma, terdiri dari enzim, proenzim dan hormon(Wikipedia, 2010).

Protein merupakan salah satu dari biomolekul raksasa, selain polisakarida, lipid, dan polinukleotida, yang merupakan penyusun utama makhluk hidup. Selain itu, protein merupakan salah satu molekul yang paling banyak diteliti dalam biokimia. Protein ditemukan oleh Jöns Jakob Berzelius pada tahun 1838. Protein sederhana dapoat dibagi menjadi dua bagian menurut bentuk molekulnya, yaitu protein globular yang berbentuk bulat dan protein fiber yang mempunyai bentuk panjang seperti serat(Budi, 2009).

Dua jenis protein globular yaitu globulin dan albumin. Albumin adalah protein yang dapat larut dalam air serta terkoagulasi oleh panas. Larutan albumin dalam air dapat diendapkan dengan penambahan amonium sulfat hingga jenuh. Albumin antara lain terdapat pada serum darah dan putih telur. Globulin mempunyai sifat sukar larut dalam air murni, tetapi dapat larut dalam larutan garam netral, misalnya NaCl encer. Larutan globulin dapat diendapkan dengan penambahan garam amoniumsulfat hingga setengah jenuh. Globulin dapat diperoleh dengan jalan mengekstraksinya dengan larutan garam (5-10%) NaCl, kemudian ekstrak yang diperoleh diencerkan dengan penambahan air. Globulin akan mengendap dan dapat dipisahkan. Seperti albumin, globulin antara lain terdapat dalam serum darah, pada otot, dan jaringan lain(poedjiadi, 2007).

Struktur protein tidak stabil karena mudah mengalami denaturasi. Denaturasi suatu protein adalah hilangnya sifat-sifat struktur lebih tinggi atau terkacaunya ikatan hidrogen dan gaya-gaya sekunder lain yang mengutuhkan molekul tersebut sehingga berakibat pada hilangnya banyak sifat fisiologis protein itu. Faktor-faktor penyebab denaturasi diantaranya, perubahan temperatur, pH, detergent, radiasi, zat pengoksidasi atau pereduksi (yang dapat mengubah hubungan S-S), dan perubahan tipe pelarut(Fessenden, 2007: 395).

Denaturasi protein meliputi gangguan dan kerusakan yang mungkin terjadi pada struktur sekunder dan tersier protein. Sejak diketahui reaksi denaturasi tidak cukup kuat untuk memutuskan ikatan peptida, dimana struktur primer protein tetap sama setelah proses denaturasi. Denaturasi terjadi karena adanya gangguan pada struktur sekunder dan tersier protein. Pada struktur protein tersier terdapat empat jenis interaksi yang membentuk ikatan pada rantai samping seperti; ikatan hidrogen, jembatan garam, ikatan disulfida dan interaksi hidrofobik non polar, yang kemungkinan mengalami gangguan. Denaturasi yang umum ditemui adalah proses presipitasi dan koagulasi protein(Roypd, 2009).

Putih telur mengandung air, protein, karbohidrat, dan mineral. Protein terdiri dari 5 bentuk yang berbeda-beda, yaitu: ovalbumin, ovomukoid, ovomusin, ovokonalbumin dan avoglobumin. Ovalbumin paling banyak terdapat pada bagiuan putih telur, yaitu sekitar 75%. Karbohidrat terdapat dalam jumlah sedikit, terdapat dalam bentuk manosa dan galaktosa (Syamsir, dkk, 1994: 34).

Protein dapat diidentifikasi dengan berbagai reaksi warna, salah satunya adalah reaksi biuret. Pada reaksi biuret, larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan CuSO₄ encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawa-senyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi positif yang ditandai dengan timbulya warna merah violet atau warna biru violet (Roypd, 2009).

III. ALAT DAN BAHAN

A. Alat

• Tabung reaksi

• Penjepit tabung reaksi

• Pipet tetes

• Kertas saring

• Corong

• Penangas air

• Sentrifuge

B. Bahan

• Serum darah ayam

• Larutan amonium sulfat, (NH₄)₂ SO₄ jenuh

• Larutan NaOH 10%

• Larutan CuSO₄ 0,1 %

• Larutan albumin telur

• Etanol 95%

IV. PROSEDUR KERJA

A. Pengendapan Protein dengan Larutan Garam Konsentrasi Tinggi (Salting Out)

B. Pemisahan Protein dengan Etanol

V. HASIL PENGAMATAN

A. Pengendapan Protein dengan Larutan Garam Konsentrasi Tinggi (Salting Out)

PERLAKUAN	HASIL PENGAMATAN
Serum + amoniumsulfat	Orange putih keruh. Lapisan bawah terdapat gumpalan putih keruh
Setelah disentrifuge	Larutan bening dibagian atas. Dibagian bawah terdapat endapan.
Endapan + CuSO4 + NaOH	Terdapat endapan berwarna krem. Larutan berwarna ungu bening
Setelah pemanasan	Larutan menjadi hijau kehitaman Endapan krem.
Filtrate + CuSO4 + NaOH	Larutan berwarna ungu bening. Endapan kuning bening
Setelah pemanasan	Larutan hijau lumut (lebih muda dari pada larutan pada endapan) Endapan kuning seperti gel.

B. Pemisahan Protein dengan Etanol

PERLAKUAN	HASIL PENGAMATAN
Tabung 1. Serum + etanol 95%	Terdapat 3 lapisan: Lapisan atas: larutan putih bening Lapisan tengah: putih Lapisan bawah: endapan orange bening
Filtrate + CuSO4 + NaOH	Larutan bening keunguan, Terdapat partikel yang melayang dalam larutan.
Setelah pemanasan	Larutan berwarna kuning bening, terdapat partikel coklat agak kehijauan, endapan coklat.
Endapan + CuSO4 + NaOH	Larutan ungu keruh, endapan berwarna krem.
Setelah pemanasan	Larutan coklat agak kehijauan, terdapat endapan coklat.
Tabung 2. Albumin + etanol 95%	Terbentuk 3 lapisan: Lapisan atas: larutan bening Lapisan tengah: larutan putih Lapisan bawah: gumpalan kental kekuningan. Pada saat penyaringan tidak didapatkan filtratnya.
Endapan + CuSO4 + NaOH	Larutan ungu bening, Terdapat endapan putih.
Setelah pemanasan	Endapan putih, larutan berwarna coklat, terdapat partikel coklat yang tersebar merata dalam larutan.

VI. ANALISIS DATA

A. Pengendapan Protein dengan Larutan Garam Konsentrasi Tinggi (Salting Out)

Protein + (NH₄)₂SO₄ → mengendap

Cu²⁺ → Cu⁺

Cu⁺ + Protein → kompleks berwarna ungu

 

B. Pemisahan Protein dengan Etanol

Protein + C₂H₅OH → terkoagulasi

Cu²⁺ → Cu⁺

Cu⁺ + Protein → kompleks berwarna ungu

 

VII. PEMBAHASAN

Serum adalah plasma darah (mengandung sekitar 90% air) tanpa fibrinogen. Serum darah terdiri dari protein (yang tidak digunakan untuk pembekuan darah) termasuk cairan elektrolit, antibodi, antigen, hormon, dan semua substansi exogenous(Wikipedia, 2010). Protein yang terdapat dalam serum terdiri dari sekitar 56% merupakan fraksi albumin, 4% α1-globulin, 10% α2-globulin, 12% β-globulin, dan 18% γ-globulin.

Protein globulin yang terdapat pada serum memiliki berbagai fungsi bioligik, diantaranya sejumlah α-globulin dan β-globulin mempunyai fungsi tranpor khusus misalnya kelompok α1-globulin yaitu transkobalamin yang mengangkut vitamin B₁₂ dan transkortin yang mengangkut kortisol, β-globulin bertanggungjawab untuk transport besi bervalensi tiga dalam plasma, γ-globulin merupakan glikoprotein yang berperan pada reaksi imun sehingga disebut immunoglobulin (IgG). Sedangkan albumin berperan besar untuk ikatan protein obat(Evanjhie, 2010).

Protein mempunyai struktur yang tidak stabil sehingga mudah mengalami denaturasi yang meliputi presipitasi dan koagulasi. Denaturasi protein ini dipengaruhi oleh pH, panas, adanya garam logam berat, perubahan tipe pelarut, dll. Pada denaturasi terjadi perubahan terhadap struktur sekunder, tersier, dan kuarterner molekul protein tanpa terjadinya pemecahan ikatan kovalen sehingga terkadang dapat berlangsung secara reversible dan dapat mengalami renaturasi atau penyusunan kembali molekul protein (Zulfikar, 2008). Sifat protein ini dapat dimanfaatkan untuk proses pemisahan protein yang merupakan makromolekul yang banyak terdapat pada serum darah.

Percobaan pertama yaitu memisahkan protein dengan cara pengendapan dengan penambahan larutan garam berkonsentrasi tinggi yang biasa disebut dengan salting out. Albumin merupakan protein yang larut dalam air sedangkan globulin mempunyai sifat sukar larut dalam air. Akan tetapi bila ke dalam serum yang mengandung kedua protein tersebut ditambahkan garam ammonium sulfat maka daya larut protein akan berkurang sehingga protein akan terpisah sebagai endapan. Dimana globulin akan mengendap pada penambahan garam ammonium sulfat setengah jenuh sedangkan albumin akan mengendap pada penambahan ammonium sulfat hingga jenuh(Poedjiadi, 2007).

Pengendapan dapat terjadi karena saat ammonium sulfat ditambahkan pada larutan protein, ion-ion garam ammonium sulfat menarik molekul air menjauh dari protein. Hal ini disebabkan ion-ion pada garam ammonium sulfat memiliki muatan berat jenis yang lebih besar dibanding protein, sehingga ketika ditambahkan dan berikatan dengan molekul air, dapat memaksa molekul protein berinteraksi dan ketika penambahan ammonium sulfat dalam jumlah cukup menyebabkan protein terpresipitasi(ddbiotechnology, 2009).

Endapan protein dapat dipisahkan dari filtratnya dengan cara penyaringan biasa dengan kertas saring. Endapan yang didapat kemudian diuji dengan uji biuret yang merupakan uji warna untuk identifikasi protein. Dimana larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO₄ encer. Uji ini untuk mendeteksi adanya ikatanikatan peptide dimana Cu²⁺ dari CuSO₄ akan direduksi menjadi Cu⁺ yang akan bereaksi dengan gugus –CO dan –NH₂ pada protein sehingga membentuk suatu kompleks

berwarna(Anonim, 2006). Dari percobaan diperoleh hasil positif untuk uji biuret terhadap endapan maupun filtrate yang ditandai dengan timbulnya warna ungu pada larutan. Hal ini menandakan dalam filtrate maupun endapan terkandung protein yang disebabkan belum semua protein terendapkan oleh penambahan ammonium sulfat. Sehingga kemungkinan ammonium sulfat yang ditambahkan belum sampai keadaan jenuh yang menyebabkan tidak semua albumin terendapkan.

Pada percobaan kedua, protein dipisahkan dari serum dengan penambahan etanol 95%. Pada percobaan ini digunakan albumin telur sebagai pembanding. Adanya penambahan pelarut organik akan mengubah (mengurangi) konstata dielektrika dari air sehingga kelarutan protein berkurang dan juga akibat etanol yang akan berkompetensi dengan protein terhadap air(Roypg, 2009). Tabung 2 yang menggunakan larutan albumin diendapkan hampir seluruhnya sehingga hampir tidak didapatkan filtrat. Sedangkan tabung 1 yang berisi serum, protein tidak terendapkan seluruhnya sehingga terbentuk 3 fase dimana lapisan atasnya adalah air dan etanol yang tidak saling bercampur sehingga akan terbentuk 2 fase larutan.

Sedangkan bagian bawahnya adalah protein yang terkoagulasi. Dari perbandingan hasil keduanya berarti albumin lebih mudah terkoagulasi oleh etanol dibandingkan globulin.

Baik filtrat maupun endapan dari serum setelah dilakukan uji biuret menunjukkan hasil yang positif. Hal ini karena di dalam filtrat masih terkandung globulin yang belum terkoagulasi seluruhnya. Endapan albumin telur juga menunjukkan uji positif yang berarti di dalam endapan tersebut terdapat protein albumin yang hampir semuanya terkoagulasi sehingga hampir tidak didapat filtrat.

VIII. KESIMPULAN

Berdasarkan data hasil pengamatan, analisis data, dan pembahasan, maka dapat disimpulkan:

1. Di dalam serum darah terkandung protein yang terdiri dari albumin dan globulin.
2. Protein dalam serum dapat dipisahkan dengan cara mengendapkannya dengan penambahan ammonium sulfat. Proses ini disebut salting out.
3. Globulin akan mengendap pada penambahan ammonium sulfat setengah jenuh, sedangkan albumin akan mengendap pada penambahan ammonium sulfat hingga jenuh.
4. Penambahan larutan garam, misalnya ammonium sulfat dapat menurunkan kelarutan protein.
5. Identifikasi adanya protein dapat dilakukan dengan uji warna biuret yang akan memberika hasil positif dengan terbentuknya kompleks berwarna ungu pada larutan.
6. Protein serum juga dapat diendapkan dengan penambahan etanol 95% yang dapat mengurangi konstanta dielektrik air sehingga kelarutan protein berkurang.
7. Albumin lebih mudah diendapkan dengan etanol dibandingkan dengan globulin.

 

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2006. Biuret Test untuk protein. http://www.scumdoctor.com/Indonesian/ nutrition/protein/Biuret-Test-For-Proteins.html [6 Juni 2010]

Budi, Darmawan Setia. 2009. Amino dan Protein. http://darmaqua.blogspot.com/

2008/04/amino-dan-protein.html [6 Juni 2010]

Ddbiotechnology. 2009. Isolasi dan Purifikasi Enzim. http://ddbiotechnology.wordpress.com/ [6 Juni 2010]

Evanjie. 2010. Plasma Darah. http://evantherapy.wordpress.com/tag/protein/ [6 Juni 2010] Fessenden, Ralp J. dan Joan S. Fessenden. 2007. Kimia Organik Jilid 2. Jakarta: Erlangga.

Kimball, John W. 2007. Biologi Jilid 2. Jakarta: Erlangga.

Poedjiadi, Anna dan F. M. Titin Supriyanti. 2007. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI press.

Roypg. 2009. Asam Amino dan Protein. http://roypg.blogspot.com/2009_02_01_archive.html [6 Juni 2010]

Syamsir, Elvira, dkk. 1994. Studi Komparatif Sifat Mutu dan Fungsional Telur Puyuh dan Telur Ayam Ras. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan: 5(3): 4.

Wikipedia. 2010. Serum Darah. http://id.wikipedia.org/wiki/Serum_darah [6 Juni 2010]

Zulfikar. 2008. Kimia Kesehatan. http://digilib.unimus.ac.id/download.php?id=2015 [6 Juni 2010]

(sumber : putu eka wahyu ratnaningsih)