LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA II : PENETAPAN KADAR KOLESTEROL

I. PELAKSANAAN PRAKTIKUM

Tujuan Hari/Tanggal Tempat

: Menentukan kadar kolesterol total dalam serum rendah dan serum tinggi. : Selasa, 11 mei 2010 : Laboratorium Kimia, Lt.2, Fakultas MIPA Universitas Mataram

II. LANDASAN TEORI

Kolesterol merupakan steroid hewani yang terdapat paling meluas dan dan dijumpai dalam hampir semua jaringan hewan. Batu kandung empedu dan kuning telur merupakan sumber yang kaya akan senyawa ini. Kolesterol merupakan zat antara yang diperlukan dalam biosintesis hormon steroid. Kolesterol dapat disintesis dari asetil koenzim A. kadar kolesterol yang tinggi dalam darah dikaitkan dengan arteriesklerosis (pengerasan pembuluh darah) yaitu suatu keadaan dimana kolesterol dan lipid-lipid lain melapisi dinding dalam pembuluh darah (Fessenden, 2007: 425).

Gambar Kolesterol

Karena tidak larut dalam darah, maka kolesterol ditransportasikan dalam sistem sirkulasi lipoprotein. Ada beberapa jenis lipoprotein di dalam darah dari ukuran besar hingga yang berukuran paling kecil: chylomicrons, very low density lipoprotein (VLDL), intermediate density lipoprotein (IDL), low density lipoprotein (LDL), dan high density lipoprotein (HDL) (Sudarma, 2009: 85).

kolesterol berfungsi membentuk dinding sel (membran sel) dalam tubuh.

Selain itu ia juga berperan penting dalam produksi hormon seks, vitamin D, serta untuk fungsi otak dan saraf. Manusia rata-rata membutuhkan 1.100 miligram kolesterol per hari untuk memelihara dinding sel dan fungsi fisiologis lain. Kolesterol yang terdapat dalam tubuh manusia berasal dari dua sumber utama yaitu dari makanan yang dikonsumsi dan dari pembentukan oleh hati. Kolesterol yang berasal dari makanan terutama terdapat pada daging, unggas, ikan, dan produk olahan susu. Jeroan daging seperti hati sangat tinggi kandungan kolesterolnya, sedangkan makanan yang berasal dari tumbuhan justru tidak mengandung kolesterol sama sekali (Akang, 2009).

Sedikitnya lebih dari separuh jumlah kolesterol dalam tubuh berasal dari sintesis (sekitar 700 mg/hari), dan sisanya berasal dari makanan sehari-hari. Pada manusia, hati menghasilkan kurang lebih 10% dari total sintesis, sementara usus sekitar 10% lainnya. Pada hakekatnya semua jaringan yang mengandung sel-sel berinti mampu mensintesis kolesterol. Fraksi mikrosomal (reticulum endoplasma) dan sitosol sel terutama bertanggung jawab atas sintesis kolesterol. Biosintesis kolesterol dapat dibagi menjadi 5 tahap yaitu, (1) Mevalonat yang merupakan senyawa enam karbon disintesis dari asetil KoA, (2) Unit isoprenoid dibentuk dari mevalonat dengan menghilangkan CO₂, (3) Enam unit isoprenoid mengadakan kondensasi untuk membentuk intermediet, skualen, (4) Skualen mengalami siklisasi untuk menghasilkan senyawa steroid induk, yaitu lanosterol, (5) Kolesterol dibentuk dari lanosterol setelah melewati beberapa tahap lebih lanjut, termasuk menghilangnya tiga gugus metil (Murai, dkk, 2003)

Adanya kolestesterol dapat ditentukan dengan menggunakan beberapa reaksi warna. Salah satu diantaranya ialah reaksi salkowski. Apabila kolesterol dilarutkan dalam kloroform dan larutan ini dituangkan di atas larutan asam sulfat pekat dengan hati-hati, maka bagian asam berwarna kekuningan dengan fluoresensi hijau bila dikenai cahaya. Bagian kloroform akan berwarna biru yang berubah menjadi merah dan ungu. Larutan kolesterol dalam kloroform bila ditambahkan anhidrida asam asetat dan asam sulfat pekat, maka larutan tersebut yang mula-mula akan berwarna merah kemudian menjadi biru dan hijau. Ini disebut reaksi Lieberman Burchard. Warna hijau yang terjadi ternyata sebanding dengan konsentrasi kolesterol. Karenanya reaksi Lieberman Burchard dapat digunakan untuk menentukan kolesterol secara kuantitatif. Dalam darah manusia normal terdapat antara 150-200 miligram tiap 100 ml darah (Poedjadi, 2007: 75-76).

Hasil pemeriksaan kadar kolesterol biasanya dinyatakan dalam milligram per 100 milliliter darah. Rentangan kadar kolesterol total dalam darah manusia ditampilkan pada tabel dibawah ini:

Kadar (mg/100 ml)
Kurang dari 200	Normal
Antara 200-239	Batas normal-tinggi
Lebih dari 240	Tinggi

(Anonim¹, 2009).

III. ALAT DAN BAHAN

A. Alat

- Tabung reaksi

- Pipet tetes

- Pipet ukur

- Rak tabung reaksi

- Penjepit tabung reaksi

- Penangas air

- Tutup tabung reaksi

- Spektrofotometer UV-VIS

- Vortex mixer

B. Bahan

- Serum kolesterol tinggi

- Serum kolesterol rendah

- Alcohol absolute

- Petroleum benzin

- Aquadest

- Colour reagent (1,0 mgr FeCl₃.6H₂O/ml asam asetat glacial)

- Asam asetat glacial

- Asam sulfat pekat

IV. PROSEDUR KERJA

A. Uji Sampel

B. Kurva Kalibrasi

III. HASIL PENGAMATAN

A. Uji Sampel

• Kolesterol Tinggi

PERLAKUAN	HASIL PENGAMATAN
+ 0,1 ml serum	Keruh keputihan, terdapat semacam koloid putih yang menyebar dalam larutan.
+ 5 ml petroleum benzin dikocok	Terbentuk 3 fase Fase atas: bening
	Fase tengah: putih kental Fase bawah: putih, seperti endapan
+ 3 ml aquadest
Sebelum dikocok Setelah dikocok	Terbentuk 3 fase Fase atas: bening Tengah: putih Fase bawah: keruh Bagian atas berupa larutan bening. Bagian bawah berupa larutan keruh, banyak terdapat seperti koloid
Diuapkan dengan penangas air	Larutan berwarna kekuningan dan menjadi sedikit.
+ 4 ml colour reagent	Terdapat seperti gel kecil, bening, dan banyak pada dinding tabung reaksi.
Dipanaskan	Terdapat gelembung dan noda lemak pada dinding tabung reaksi
+ 3 ml H3SO4 pekat	Terbentuk cincin orange kecoklatan (jelas)

• Kolesterol Rendah

PERLAKUAN	HASIL PENGAMATAN
+ 0,1 ml serum	Terdapat lebih banyak endapan putih yang menyebar dalam larutan, larutan berwarna keruh keputihan.
+ 5 ml petroleum benzin
Sebelum dikocok Setelah dikocok	Terbentuk 3 fase Fase atas: bening Fase tengah: sangat kental, keruh kekuningan Fase bawah: seperti terbentuk endapan putih Terbentuk 3 fase Fase atas: bening Fase tengah: kental Fase bawah: seperti endapan putih
+ 3 ml aquadest
Sebelum dikocok Setelah dikocok	Terbentuk 3 fase Fase atas: berwarna bening Fase tengah: putih Fase bawah: kental Terbentuk 3 fase Fase atas: bening Fase tengah: seperti ada endapan Fase bawah: agak keruh
Diuapkan dalam penangas air	Terbentuk larutan bening kekuningan, larutan menjadi sedikit.
+ 4 ml colour reagent	Terbentuk gel bening (sedikit) pada dinding, dan sedikit gelembung.
Dipanaskan	Terdapat gelembung dan sedikit noda lemak pada dinding dalam larutan
+ 3 ml H2SO4 pekat	Terdapat cincin orange (kabur, tidak teratur)

• Blanko

PERLAKUAN	HASIL PENGAMATAN
+ 3 ml H2SO4 pekat	Terbentuk 3 fase Fase atas: berwarna bening agak pink Fase tengah: orange bening Fase bawah: putih bening

• Hasil Pengukuran dengan UV-VIS

TABUNG	% T	ABSOBANS
Blanko Sampel kolesterol rendah Sampel kolesterol tinggi	077,8 087,0 079,8	0,098 0,061 0,097

B. Kurva Kalibrasi

PERLAKUAN	0,5 ml	1 ml	2 ml
Dipanaskan	Larut bening	Bening larut	Bening larut
+ H2SO4 pekat	-	-	2 fase

PERLAKUAN	% T	ABSORBANS
0,5 ml	088,3	0,050
1 ml	087,4	0,057
2 ml	083,5	0,077

IV. ANALISIS DATA

persamaan reaksi

Perhitungan

a. Kolesterol volume 0.5 mL

Kadar kolesterol standar = 1.25 mg

Massa = V x kadar

= 0.5 mLx 0.05 mg/mL

= 0.025 mg

b. Kolesterol volume 1 mL

Kadar kolesterol standar = 0.05 mg/mL

Massa = V x kadar

= 1.0 mLx 0.05 mg/mL

= 0.005 mg

c. Kolesterol volume 2 mL

Kadar kolesterol standar = 0.05 mg/mL

Massa = V x kadar

= 2.0 mLx 0.05 mg/mL petroleum eter

= 1.0 mg

Kurva Kalibrasi

Berdasarkan kurva didapatkan persamaan Y = 0,685X + 0,016

1. Penentuan Kadar Kolestrol Dalam Serum Darah

a. Kadar Kolesterol Dalam Serum Tinggi

A larutan serum tinggi = 0.097 = Y

Y = 0.685X + 0.016

0.097 = 0.685X + 0.016

X = 0.118

Jadi kadar kolesterol dalam serum tinggi = 0.118 mg/0.1 mL = 118 mg/dL Sehingga kadar kolesterol tersebut tergolong rendah.

b.Kadar Kolesterol Dalam Serum Rendah

A larutan serum tinggi = 0.097 = Y

Y = 0.685X + 0.016

0.061 = 0.685X + 0.016

X = 0.065

Jadi kadar kolesterol dalam serum tinggi = 0.065 mg/0.1 mL = 65 mg/dL Sehingga kadar kolesterol tersebut tergolong rendah

VII. PEMBAHASAN

Kolesterol merupakan salah satu sterol yang penting yang terdapat dalam jaringan dan lipoprotein plasma. Biasanya terdapat dalam bentuk kolesterol bebas atau gabungan dengan asam lemak rantai panjang seperti ester kolesteril. Kolesterol tidak larut dalam air karena adanya perbedaan kepolaran (Anonim, 2010). Akan tetapi kolesterol larut dalam pelarut lemak dan sangat nonpolar seperti petroleum benzin.

Untuk mendapatkan kolesterol murni dari serum rendah maupun tinggi maka

dilakukan pemisahan yang menggunakan prinsip seperti ekstraksi pelarut. Alkohol absolute atau yang lebih dikenal dengan etanol dicampurkan dengan serum untuk melarutkan senyawa-senyawa lain selain kolesterol karena kolesterol tidak larut dalam pelarut ini. Penambahan petroleum benzin ini berfungsi sebagai pelarut bagi kolesterol. Setelah diaduk terlihat seperti ada 3 fase, kemudian ditambahkan air agar pemisahannya lebih jelas sehingga akan terbentuk 2 fase dengan fase air dibagian bawah. Etanol ini sendiri merupakan pelarut yang juga dapat larut dalam air (Anonim³, 2010). Larutan yang bening dibagian atas diambil kemudian pelarutnya diuapkan dalam penangas air sehingga didapatkan kolesterol murni untuk selanjutnya dilakukan uji kadar totalnya.

Pengujian kuantitatif kadar kolesterol total ini dilakukan dengan teknik Lieberman Burchard. Dimana dalam praktikum ini yang digunakan adalah colour reagent yang merupakan FeCl₃.6H₂O dalam asam asetat glasial untuk melarutkan kolesterol. Setelah penambahan asam sulfat pekat larutan tetap bening dan terdapat cincin berwarna orange dibagian tengahnya. Asam sulfat ini berguna untuk membentuk kompleks warna. Larutan ini setelah didiamkan dalam ruang gelap ternyata tidak mengalami perubahan warna. Larutan didiamkan ditempat gelap agar tidak ada penyerapan cahaya oleh kolesterol sebelum kolesterol diukur dengan UV-VIS karena hal ini tentunya dapat mempengaruhi serapan cahaya pada saat pengukuran sehingga turut mempengaruhi hasil pengukuran (Murray, 2003). Seharusnya larutan menjadi berwarna kemerahan setelah ditambahkan asam sulfat pekat yang setelah didiamkan akan akan berubah menjadi warna biru dan hijau. Dimana warna hijau yang terjadi sebanding dengan kadar kolesterol. Akan tetapi larutan tetap bening setelah disimpan diruang gelap. Dari hasil pengukuran didapatkan absorbans untuk kolesterol rendah sebesar 0,061 dan absorbans kolesterol tinggi sebesar 0,097.

Untuk menentukan kadar kolesterol sebelumnya dibuat terlebih dahulu kurva kalibrasi larutan kolesterol standar 0,05 mg/ml petroleum benzin dan ditentukan persamaan garisnya. Kadar kolesterol total didapat dengan memasukkan nilai absorbans yang didapat dari hasil pengukuran ke dalam persamaan yang didapat. Sehingga dari hasil perhitungan diperoleh kadar kolesterol rendah sebesar 65 mg/100 ml darah dan kadar kolesterol tinggi sebesar 118 mg/100 ml darah dengan persamaan grafik Y= 0,685X + 0,016. Hasil yang didapat kemudian dibandingkan dengan standar kadar kolesterol dalam darah dan didapat kadar serum rendah maupun kadar serum tinggi yang masih dalam batas rendah karena biasanya rentang normal kolesterol sekitar 150-200 mg/100 ml darah (poedjiadi, 2007).

VII. KESIMPULAN

Berdasarkan data hasil pengamatan, analisis data dan pembahasan, maka dapat disimpulkan:

1. Penentuan kadar kolesterol total dapat dilakukan dengan teknik Lieberman Burchard dimana kadar kolesterol dapat dihitung berdasarkan nilai absorbans yang didapat.
2. Pemisahan kolesterol dari serum untuk mendapatkan kolesterol murni menggunakan prinsip ekstraksi pelarut yaitu kolesterol larut dalam petroleum benzin sedang senyawa-senyawa lainnya larut dalam etanol. Dimana etanol dapat larut dalam air sehingga kolesterol dapat dipisahkan.
3. Kolesterol bersifat dapat menyerap cahaya dan absorbansinya dapat diukur dengan UV-VIS.
4. Kadar kolesterol total untuk kolesterol rendah sebesar 65 mg/100 ml darah sedangkan kadar kolesterol total untuk kolesterol tinggi sebesar 118 mg/100 ml darah.
5. Kadar kolesterol total untuk kolesterol rendah maupun tinggi masih tergolong normal, sedangkan kadar kolesterol total untuk kolesterol tinggi tergolong rendah.

DAFTAR PUSTAKA

Akang. 2009. Si Baik dan Si Jahat Itu Bernama Kolesterol. http://aa-kolesterol.blogspot.com/ 2009/12/si-jahat-dan-si-baik-itu-bernama_06.html [19 Mei 2010].

Anonim¹. 2009. Apa Arti Hasil Test Kolesterol Darah Anda. http://www.mangkukmerah. com/ [17 mei 2010].

Anonim². 2010. Air, Si Cantik yang Tersia-sia. http://www.chem-is-try.org/ artikel_kimia/kimia_anorganik/air-si-cantik-yang-tersia-sia/ [17 Mei 2010].

Anonim³. 2010. Etanol. http://id.wikipedia.org/wiki/Etanol [16 Mei 2010].

Fessenden, Ralp J. dan Joan S. Fessenden. 2009. Kimia Organik Jilid 2. Jakarta: Erlangga.

Murray, Robert K. 2003. Biokimia Harper. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.

Poedjadi, Anna dan F. M. Supriyanti. 2007. Dasar-Dasar biokimia. Jakarta: UI Press.

Sudarma, I Made. 2009. Kimia Bahan Alam. Mataram: FMIPA Press.

(sumber : putu eka wahyu ratnaningsih)